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我是北京大学生物信息中心高歌
下面，让我们继续课程。
在上一单元中，我们围绕着非编码RNA的鉴定，介绍了feature selection的相关方法
在本单元里，我们将继续针对非编码RNA的功能注释，介绍差异基因表达分析与聚类
鉴于本单元会涉及较多的统计知识，
因此对于拓展性的内容，我们均在右上角标记为Additional Information，
相关内容均不作为考试要求
在鉴定出ncRNA之后，我们如何来推断其可能的生物学功能呢？
首先，对于miRNA等作用机制比较清楚的ncRNA，我们可以参考其作用机制，利用碱基互补等方式预测其靶标，并进而推断其生物学功能
然而，对于long non-coding RNA等具体作用机制尚待明确的非编码RNA，这个方法就不适用了
这时，我们可以根据在表达调控网络中，表达相关的基因往往具有功能相关性这一特征，利用表达关联来推断其功能
具体来说，在实际研究中，我们主要关注两类表达关联：
在不同条件下差异表达的基因，
及在不同条件下共表达的基因。
下面，我们就分别对这两类进行讨论
在不需要考虑实验误差的理想世界里，差异表达基因检测是很容易的(trivial)：
我们只需要直接比较不同条件下检测出的表达量数值即可。
然而，在现实世界中，情况要复杂的多
事实上，在真实的实验过程中，由于随机误差(random error)的存在，我们得到的测量值永远是一个分布而非一个定值。
因此，不同条件下基因表达水平的比较实质上是对两个分布的比较。
换句话说，除了均值之外，我们还需要考虑方差的影响
例如，从这个图中，我们可以很有把握的说基因g在不同条件下表达发生了改变——
因为基因g在条件2下的最小值也比条件1下的最大值来的大。
然而，在均值不变的前提下，只是对方差进行调整，结论就可能完全不同。
现在可以看到，基因g在条件2下的最小值较条件1下的最大值来的小，
从而使得我们不得不考虑另外一种可能性：也许基因g在两个条件下的真实表达并没有差异——
换句话说我观察到均值差异d可能只是由随机误差引起的假象
因此，就需要利用统计学的方法，基于概率模型进行统计推断。
具体来说，我们需要构造一个考虑了方差的统计量(statistic)，
而后基于这个统计量的零分布(NULL distribution)来计算每个基因的p-value，
最后选择小于给定cut-off p-value的基因作为有统计显著差异表达的基因。
例如，在经典的t-test中构造的t统计量即可视为两个分布均值之差与其标准差之间的比值(ratio)。
在假定两个分布均为正态的前提下，t统计量的零分布即为t分布，从而可以方便的根据t统计量计算出p-value。
然而，经典的t检验除了对分布有要求外，还需要对每个条件下均有足够多的重复，
这对于RNA-Seq数据分析来说往往是不现实的。
因此，针对RNA-Seq数据的特点，不同研究组构基于Possion、负二项分布等构造了不同的统计量和差异表达计算方法。
由于这些方法基于不同的假设，其零分布之间也存在显著的差异，从而导致了最终p-value乃至calling结果的差异。
为了便于选择合适的方法，
Doron Betel等人基于多组数据集对常用的差异表达工具进行了系统评估，
有兴趣的同学可以参考，同时相关的文章也在本周的student presentation中进行了报告
P-value本质上是对统计错误可能性的一个概率表示。
具体来说，我们在实际中可能会碰到两类错误：
一类错误又称假阳性错误，是指将实际并没有差异表达的基因错当成了有差异表达的基因；
二类错误又称假阴性错误，是指将实际表达有差异的基因错当成了没有差异表达。
这两类错误存在着此消彼长的关系。
一般来说，我们会用p-value表示一次检验中发生一类错误——也就是假阳性错误——的概率
在实践中，我们通常要对多个基因重复进行统计检验。
这时，就会遇到多重检验问题(Multiple Testing Issue)。
例如，我们对20个不同的基因依次进行统计检验，每次检验的p-value都为0.05，那么
也就是说，每次我们犯错误的概率是0.05
换言之，每次我们不犯错误的概率就是1-0.05=0.95
根据乘法原理，连续20次都不犯错误的概率就是0.95的20次方，约等于0.358
换言之，即使每次的出错概率都是0.05，但最终仍有超过一半的概率至少犯一次错误！
这也就是所谓的Multiple Testing Issue.
为了解决这个问题，最简单的办法就是将p-value的cut-off改的更严。
例如，Bonferroni correction中，会将检验得到的原始p-value乘以检验进行的次数。
因此，假如我们对人类基因组3万个基因只在原始p-value小于0.05/30000=1.67x10^-6时才将之作为差异表达基因，
就可以确保即使在最糟糕的情况下，也可以确保假阳性错误发生的概率小于0.05
然而，在实践中Bonferroni correction往往过于严格了，
为了确保降低假阳性而抬高了假阴性错误发生的概率，从而降低了统计检验的效力(power)
同时，相对于全体进行统计检验的基因，我们在实际研究中往往更关心在已经被标记为差异表达的基因中，有多少假阳性的基因。
换句话说，我们关心的是FDR而不是FWER
这时，可以将p-value转化为q-value。
类似于p-value，q-value也是对统计错误可能性的表示(measure)。
然而与p-value不同的是，q-value衡量的是False Discovery Rate，
换句话说，对于给定基因g，q-value给出的是在和基因g一样或更显著的差异基因群体中，假阳性发生的比率
与差异表达类似，在不同条件下共表达的关系也可以用来推断基因功能
对不同条件下多个基因的表达进行聚类分析(clustering)可以帮助快速寻找共表达基因
正确的聚类分析，不但有助于推断基因的功能，还可以有效的发现基因之间存在的调控关系。
距离度量是聚类方法的核心。
这里的距离度量，是指用来衡量两个基因的表达模式之间的相似程度。
常用的距离度量有欧氏距离，又称绝对距离；和Pearson距离，又称关联距离。
其中欧氏距离关心的是表达量，也就是两个基因在表达水平之间的相似程度
而相关性距离则关心的是表达模式，也就是两个基因在表达变化上的一致性
不同的距离度量，可以得到迥然不同的结果。
例如，按照关联距离——也就是表达模式来看，图中的蓝点与红点距离最近
因为它们的变化基本一致，而蓝点和灰点的距离则较远；
然而，如果按照欧氏距离，那么由于蓝点与灰点的绝对值——也就是表达量——接近，它们之间的距离反而更小。
由于共表达通常是指表达的变化趋势，因此在实际分析中关联距离使用的频率更高一些
然而，在应用Pearson距离时，也要注意outlier对它的影响。
由于Pearson距离依赖于群体水平的协方差，
因此如果有一些特殊的outlier，会对最终的结果产生极大的影响。
好，以上我们介绍了差异表达分析与聚类中需要注意的若干事宜。
这是本节的思考题，
欢迎有兴趣的同学认真思考，并积极通过论坛与其他同学及助教进行交流讨论
Ge Gao 高歌, Ph.D.Assistant Professor, Principle Investigator
Liping Wei 魏丽萍, Ph.D.Professor, Director
