Introduction à l'optique non-linéaire, qui correspond au régime d'interaction laser-matière que l'on peut explorer à l'aide de lasers intenses, comme par exemple les lasers femtosecondes.
Fluorescence par excitation à deux photons
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非线性光学
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Autres effets non-linéaires du troisième ordre
Ce chapitre porte sur la saturation d’absorption, l’absorption à deux photons, la fluorescence par excitation à deux photons et la génération de troisième harmonique. Les applications de certains de ces phénomènes à la microscopie non-linéaire d’objets biologiques seront illustrées par des résultats expérimentaux obtenus au Laboratoire d’Optique et Biosciences.
與講師見面
Manuel JoffreDR CNRS et Professeur associé à l'Ecole polytechnique
Département de Physique
Vincent KemlinChargé d'enseignement à l'Ecole polytechnique
Physics
Dans cette vidéo,
nous allons nous intéresser à une conséquence de l’absorption à
deux photons qui est la fluorescence par excitation à deux photons.
Et tout d’abord il faut, euh, rappeler ce qu’est la, la fluorescence.
Donc pour ça je vais faire une expérience ; je vais prendre ce faisceau laser qui
est, qui est un laser, un laser vert et je vais l’envoyer dans ce, dans ce
matériau qui est un verre dopé avec des, avec des molécules fluorescentes.
Comme vous pouvez le voir ce qu’on observe c’est que le matériau émet de la
lumière dans toutes les directions avec une couleur différente de celle du
laser incident.
Le laser était vert et là vous voyez une couleur,
une couleur qui est plutôt dans le domaine de l’orange.
Et, et ce phénomène c’est la fluorescence.
Donc, d’où vient ce changement de couleur?
Il vient du fait qu’on va avoir une absorption du laser incident donc qui est
un laser, qui est un laser vert qui va exciter notre,
notre système et on aura à l’intérieur des molécules, hein,
qui sont des systèmes assez compliqués avec beaucoup de niveaux d’énergies,
On va avoir tout d’abord une relaxation assez, assez rapide, vers un état qui va
se désexciter par émission spontanée en émettant des photons de fréquence oméga F,
la fréquence de fluorescence, et ensuite le système va revenir à l’état d’équilibre
où il pourra comme ça faire un grand nombre de cycles d’absorption, émission.
Et, donc vous voyez c’est comme ceci qu’on peut avoir une émission à une fréquence,
à une fréquence différente.
Alors c’est très différent des phénomènes d’optique non-linéaire dont on
a parlé jusqu’à maintenant qui permettait de changer la, la, la,
la fréquence et donc la couleur d’un faisceau lumineux.
Là, le faisceau qui est émis, euh,
est un faisceau qui est émis par émission spontanée donc ça correspond en fait à
un champ aléatoire, euh, dont on ne connait pas du tout la phase et qui,
pour cette raison va être émis dans toutes les directions.
À l’inverse les effets d’optique non-linéaire qu’on a vu
jusqu’à maintenant, qui changeaient la couleur du faisceau lumineux,
on pouvait parfaitement prédire dans quelle direction était émis le faisceau et
quel était, quel était la phase du faisceau émis.
Donc l’optique non-linéaire ça permet de changer la fréquence et la
couleur d’un faisceau lumineux de manière cohérente alors que là c’est un
processus incohérent qui, par émission spontanée vous fait donc, euh, une,
une émission omnidirectionnelle à une nouvelle fréquence.
Alors vous voyez que la condition pour que ce processus de fluorescence puisse se
produire c’est évidemment que l’énergie des photons absorbés soit supérieure à
l’énergie des photons, euh, des photons émis puisque ce mécanisme de
relaxation ici, se fera toujours avec une, une perte d’énergie.
Donc il faut que la fréquence oméga du laser d’excitation soit
toujours supérieure à la fréquence des photons émis.
C’était bien le cas dans, dans l’expérience précédente puisque j’avais un
laser vert donc avec une longueur d’onde de l’ordre de 530 nanomètres et
puis une émission avec, euh, donc dans le domaine de,
de l’orange qui correspond à une longueur d’onde plutôt 550-560 nanomètres,
donc une longueur d’onde plus grande que la longueur d’onde de départ.
Donc évidemment cette relation oméga inférieur,
supérieur à oméga F peut encore s’écrire lambda inférieur à lambda F.
Il faut exciter le système avec une longueur d’onde plus courte que la
longueur d’onde de fluorescence.
Si on excite le système avec une fréquence plus petite, hein, donc
comme représenté ici et bien évidemment on ne pourra pas induire la transition.
Donc je peux faire l’expérience avec, avec ce, ce laser, ce laser rouge, hein, donc,
j’ai ici un faisceau laser, un faisceau laser rouge et maintenant si j’envoie le
faisceau laser au travers de, au travers de cette lame fluorescente et bien,
vous voyez que le faisceau laser n’émet pas du tout de fluorescence,
il est même transmis sans absorption par, par la lame alors que le laser précédent,
lui, nous faisait une fluorescence et vous voyez que cette fois-ci il n’y a pas de
faisceau transmis, le faisceau est complètement absorbé par la
lame évidemment en régime résonnant, en régime absorbant.
Donc vous voyez que si la fréquence du laser est plus petite que la fréquence de
la transition, on ne pourra pas avoir d’absorption.
Donc ça c’est vrai en régime linéaire.
Et c’est là qu’intervient l’optique non-linéaire c’est qu’évidemment si on
peut avoir un mécanisme d’absorption à deux photons, et bien,
on va être capables d’exciter ce système.
C’est la fluorescence par excitation à deux photons.
Vous voyez que là si maintenant j’ai deux photons qui s’ajoutent pour faire la
transition et bien je vais pouvoir avoir, euh, une émission de fluorescence.
Donc c’est maintenant une situation où, oméga est inférieur à oméga F,
par contre évidemment, il faut que deux oméga, deux fois la fréquence des photons,
soit supérieur à oméga F hein, pour qu’on ait assez d’énergie avec deux
photons pour pouvoir exciter évidemment la fluorescence.
La probabilité de ce, de ce processus de fluorescence par excitation à
deux photons, bah, elle est évidemment proportionnelle à la probabilité
d’absorption, euh, à deux photons et donc on aura une probabilité qui va
être proportionnelle au carré de l’intensité du faisceau laser.
Et donc qui, comme l’absorption à deux photons, va être privilégiée lorsqu’on
a un faisceau laser très focalisé ou un laser à impulsions brèves.
Alors pour mettre en évidence ce phénomène de fluorescence par excitation à
deux photons, il va nous falloir un laser beaucoup plus intense que ce
modeste pointeur laser et pour ça on va aller dans une des salles d’expérience du
laboratoire d’optique et biosciences.
Comme vous le voyez sur cette expérience, on place la lame dans le faisceau laser et
on observe la fluorescence, euh, au niveau de l’impact du laser sur
la lame alors que la longueur d’onde de ce laser, qui est un laser titane saphir
amplifié est de 800 nanomètres et donc est beaucoup trop grande par rapport à
la longueur d’onde de fluorescence qui est de l’ordre de 550, euh, nanomètres.
Donc ça vous montre qu’un laser femtosecondes,
parce que l’intensité va être très importante, et bien, va permettre cette
absorption à deux photons et donc le mécanisme de fluorescence qui en découle.
Dans cette autre expérience,
on utilise un laser femtosecondes mais moins intense que le précédent c’est pas
un laser amplifié mais c’est juste un oscillateur femtosecondes de moindre,
de moindre puissance comme on le verra la, la semaine prochaine.
Ce qu’on va faire c’est qu’on va envoyer ce faisceau laser sur la lentille que
vous voyez ici et donc en aval de la lentille, le faisceau va être focalisé.
Et si maintenant je prends la même lame que tout à l’heure et que je
la place juste avant la lentille ou juste après la lentille,
je ne vois pas de fluorescence par absorption à deux photons.
Et vous voyez que lorsque je déplace la lame,
lorsque je m’approche du foyer de la lentille, et bien, je peux observer ce
phénomène de fluorescence par absorption à deux photons ce qui vous montre que,
effectivement, c’est lorsque on a la, le diamètre du faisceau le
plus petit possible qu’on va avoir la probabilité maximale d’absorption à
deux photons et donc de fluorescence par excitation à deux photons.
C’est cette propriété qu’on vient de voir expérimentalement ; c’est-à-dire que,
le fait que la fluorescence va être localisée au foyer du faisceau laser,
qu’on utilise dans ce qu’on appelle la microscopie multi-photonique à
balayage ou la microscopie non-linéaire à balayage.
L’idée est d’exploiter ce phénomène de fluorescence par excitation à
deux photons, euh, pour étudier le,
la structure tridimensionnelle de systèmes biologiques, par exemple.
Donc le principe de l’expérience c’est de prendre un faisceau laser,
de le focaliser à l’aide d’une lentille dans un matériau ; le processus de
fluorescence va être localisé au foyer du faisceau laser, donc en ce point-là,
ce qui va émettre des photons de fluorescence dans toutes les directions ;
et si j’utilise un filtre qui coupe le faisceau laser incident à
800 nanomètres et que je mets un détecteur ici, et bien mes photons de fluorescence,
eux, vont traverser le filtre et vont pouvoir atteindre le détecteur.
Donc si je mesure simplement avec ce détecteur le,
le taux de fluorescence, et bien je vais pouvoir avoir une idée de
la concentration de molécules fluorescentes au foyer du laser.
Et ensuite il suffira de déplacer le,
le foyer du laser, soit dans les directions x et y
en changeant l’angle de ce miroir dans les deux directions thêta x et thêta y.
Et comme vous le savez, au foyer d’une lentille, et bien,
lorsque je change l’angle d’incidence sur la lentille je vais, euh, déplacer, la,
je vais déplacer la position x du foyer dans le plan transverse selon la relation
x égal F multiplié par thêta x, lorsque l’angle thêta x est suffisamment petit.
Donc en faisant varier l’angle thêta x,
je vais pouvoir balayer la direction x comme ceci.
De la même manière, en changeant l’angle thêta y, je pourrai balayer la direction y
perpendiculaire au plan de la figure et puis en déplaçant l’échantillon à l’aide
d’une /i de translation, je vais pouvoir me déplacer le long de la direction z.
Et vous voyez que comme ceci je vais pouvoir mesurer la concentration de
ces molécules fluorescentes en trois dimensions, dans mon,
dans mon échantillon.
Donc c’est ce qu’on appelle la microscopie non-linéaire à balayage, euh,
qui a beaucoup d’avantages.
Le premier avantage, qu’on vient de voir,
c’est que cette méthode a une résolution tridimensionnelle intrinsèque.
Il existe d’autres méthodes d’imagerie en trois dimensions qui utilisent par exemple
la fluorescence, la fluorescence à un photon, mais dans ce cas-là, on n’a pas de
résolution tridimensionnelle intrinsèque, la fluorescence va venir de tous les
points de l’échantillon et il faut utiliser une géométrie particulière qu’on
appelle la microscopie confocale pour retrouver cette résolution 3D.
Ici c’est pas nécessaire,
on sait que les photons ne vont venir que du foyer du faisceau laser.
Le, une des conséquences c’est que cette méthode, euh, paradoxalement, bien qu’on
utilise des impulsions laser femtosecondes qui sont relativement intenses,
aura une moindre phototoxicité par rapport à la microscopie de fluorescence.
La raison c’est que ce cycle d’absorption, émission, qui euh, qui, euh, qui
si on le fait trop, un trop grand nombre de fois va induire un, un dommage dans le,
dans le système, va, va, va, va rendre les molécules non fluorescentes par exemple.
Et bien ce, ce, ce, ce phénomène d’absorption, émission,
dans la microscopie non-linéaire, il ne se produit que au foyer, alors que dans la
microscopie de fluorescence confocale il va se produire dans tout l’échantillon et
c’est à posteriori qu’on va sélectionner les zones de l’échantillon qui,
qui émettent de la lumière.
Donc c’est le deuxième avantage de cette méthode de
microscopie non-linéaire à balayage.
Un troisième avantage c’est qu’on a une plus grande profondeur de pénétration.
La raison c’est que, on excite le système dans l’infrarouge, par exemple à une
longueur d’onde de 800 nanomètres et que la diffusion dans les tissus biologiques,
par exemple, va être beaucoup plus faible pour de grandes valeurs de la
longueur d’onde que pour de petites valeurs de la longueur d’onde.
Donc, par rapport à la microscopie de fluorescence,
où on était obligés d’exciter le système directement dans le visible, on aura une
diffusion qui va très rapidement nuire à la qualité, à la résolution spatiale des
images et qui fait qu’on pourra pas aller très profond dans le système étudié.
Donc ça, ça va nous permettre d’étudier des volumes plus grands en fait de,
de systèmes biologiques.
Et enfin un dernier avantage c’est que on est, là j’ai parlé de la microscopie de
fluorescence par absorption à deux photons, mais en fait,
le principe qui nous intéresse c’est tout simplement que le signal détecté varie de
manière non-linéaire par rapport à l’intensité du faisceau laser.
Donc, tout phénomène d’optique non-linéaire peut être utilisé.
Donc, celui qu’on vient de voir, donc, qui en anglais s’écrit, euh, s'écrit 2PEF,
two Photon Excited Fluorescence, hein,
la fluorescence par excitation à deux photons.
Mais également la génération de seconde harmonique, la génération de troisième
harmonique ; tout effet d’optique non-linéaire qui dépend de manière
non-linéaire de l’intensité aura les mêmes propriétés, hein, que la, que la,
que la, que la fluorescence par excitation à deux photons et donc nous permettra de,
d’observer des images de systèmes biologiques,
éventuellement en combinant toutes ces méthodes.
Vous pourrez en savoir plus sur la microscopie non-linéaire à balayage en
visionnant la vidéo d’illustration expérimentale de cette semaine,
où vous pourrez visiter l’équipe de microscopie non-linéaire du
laboratoire d’optique et biosciences.
