Знаете, как скрестить мышь с медузой? Или, может быть, хотите научиться собирать конструктор из вируса, человека и быка? В нашем курсе мы расскажем вам о том, какие «пазлы» уже умеют складывать учёные и как трансгенные технологии влияют на нашу жизнь. ГМО — эти три буквы держат в страхе весь мир. Сегодня больше 80% россиян боятся генетически модифицированных организмов, не подозревая о том, что их собственные организмы в своё время уже подверглись генетической модификации. На протяжении миллионов лет вирусы, первые «генные инженеры», успешно меняли геном человека, и каждый из нас на целых 8% вирус. Из нашего курса вы узнаете, что же такое ГМО и зачем человек создал технологии трансгенеза, как работает трансгенная конструкция и какими способами её можно доставить в клетку. Мы познакомим вас с новейшими системами редактирования генома, расскажем о том, как трансгенные животные помогают исследователям в борьбе с наследственными заболеваниями и старением. Вы собственными глазами увидите светящихся рыбок и мышей и побываете в лаборатории, где из опаснейших вирусов делают безопасные для того, чтобы они служили на пользу человечеству. Добро пожаловать на курс «ГМО: технологии создания и применение». Мы научим вас делать из мухи слона!
4.11. Бонус-лекция. Готовим вирусы в лаборатории!
Loading...
來自 Novosibirsk State University 的課程
ГМО: технологии создания и применение
169 個評分
從本節課中
Трансгенез с помощью вирусов
Тема этого модуля — создание трансгенных организмов с помощью разнообразных вирусов. Мы поговорим о строении и жизненном цикле лентивирусов на примере вируса иммунодефицита человека, о том, как его модифицируют, чтобы сделать безопасным, как на его основе создают конструкции для борьбы с раком и наследственными болезнями. Вы узнаете, что первые трансгенные люди появились ещё в 2000-м году, что вирус бешенства можно использовать для изучения нервной системы, что клетки можно перепрограммировать, и о многом, многом другом.
與講師見面
Алексей Мензоровкандидат биологических наук, старший преподаватель
Кафедра цитологии и генетики факультета естественных наук НГУ
Нариман Баттулинкандидат биологических наук, старший преподаватель
Кафедра цитологии и генетики факультета естественных наук НГУ
Вениамин Фишманкандидат биологических наук, преподаватель
Кафедра молекулярной биологии факультета естественных наук НГУ
[МУЗЫКА] [МУЗЫКА]
Мы находимся
в лаборатории генетики и развития в Институте цитологии и генетики.
Сегодня здесь мы с вами приготовим самые настоящие псевдолентивирусы.
Те, о которых мы говорили в предыдущих лекциях.
Вы уже знаете, что для того чтобы приготовить псевдовирусы,
нам необходимы специальные клетки, клетки-упаковщики, или клетки-хелперы.
Поэтому для того чтобы начать, нам нужно сначала разобраться,
как же клетки млекопитающих вообще могут жить в лаборатории и какие условия
им для этого нужны.
А условия нужны достаточно особенные.
Дело в том, что в нашем организме концентрация углекислого газа
CO₂ намного выше, чем в атмосферном воздухе.
В крови она составляет около 6 % и в межклеточном веществе около 5 %.
Поэтому для того чтобы клетки могли жить вне организма млекопитающих,
они поддерживаются в специально искусственно
созданных условиях повышенной концентрации CO₂ 5 %.
Это обеспечивает нам вот такой прибор CO₂-инкубатор.
У него есть дополнительный баллон с углекислотой, и он, измеряя количество
углекислого газа в каждый момент времени, постоянно подкачивает CO₂ из баллона,
для того чтобы поддерживать концентрацию 5 %.
Давайте заглянем внутрь.
И именно внутри него клетки и живут.
Все вот эти разные формы и разного размера чашечки заполнены клетками.
Например, вот на такой чашке, живет много разных клеток,
каждая в своей отдельной луночке.
Нам сейчас понадобится вот эта
чашка с клетками, которые называются феникс.
Это человеческие клетки, отличительной особенностью
которых является то, что они могут неограниченно делиться.
Вообще, в норме клетки человека и других млекопитающих,
как в культуре, так и в организме, делиться до бесконечности не могут.
Они делятся ограниченно, и после этого деление прекращают.
Но есть особые типы клеток,
которые обладают свойством иммортальности, или неограниченного деления.
Это на самом деле раковые клетки.
Так вот, клетки феникс — это как раз раковые клетки человека.
Работать с клетками феникс мы будем в этом специальном ламинаре.
Ламинар необходим для того, чтобы никакие микробы и микроорганизмы,
которые находятся в окружающем воздухе, не могли попасть в среду, в которой живут
клетки, и заразить ее и начать там вместе с нашими клетками размножаться.
Все, что находится внутри ламинара, является стерильным,
и поэтому когда мы сами работаем в ламинаре,
мы тоже соблюдаем определенные меры предосторожности, например,
обрабатываем руки спиртом или желательно надеваем стерильные халат и перчатки,
для того чтобы не занести внутрь никакую инфекцию,
которая могла бы размножаться в наших клетках или в их среде.
А воздушная стена, которая располагается на входе внутрь поверхности ламинара,
преграждает путь для различных опасных для клеток микроорганизмов.
Давайте посмотрим для начала, как вообще клетки выглядят.
Для этого мы используем обычный микроскоп.
[ЗВУК] Видно,
что клетки здесь занимают большую часть чашки сосуда, на которой они растут.
Больше чем 90 % ими занято, то есть осталось совсем мало свободного места.
И причина этого в том, что они, как я уже сказал, культура иммортализованная,
то есть может неограниченно делиться.
И вот они делились до тех пор, пока не заняли уже почти все место,
если будут дальше делиться, то вообще займут всю чашку.
Ну и вот, собственно, эти клетки сейчас находятся как раз в идеальном состоянии,
для того чтобы их использовать для приготовления вируса.
Давайте приступим.
Геном вирусов в нашем эксперименте разделен на несколько частей.
Вы помните,
это стандартная мера безопасности при работе с псевдолентивирусами.
Мы будем использовать кодирующие части от вирусов везикулярного стоматита лошадей,
для того чтобы получить белки-рецепторы, необходимые для нашего вируса.
Вы, наверное, это тоже помните,
это так называемая стандартная процедура псевдотипирования вирусов.
Затем у нас будут еще две конструкции, кодирующие белки,
необходимые для размножения вируса, но здесь важно то,
что в состав генома вируса кодирующие части,
отвечающие за синтез этих белков, не попадут.
То есть они будут работать только на стадии размножения вируса в наших
клетках-упаковщиках, в итоговом вирусе их не будет.
И наконец, последняя конструкция, можно сказать, самая главная.
Она, собственно, содержит концевые повторы вирусного генома и ψ-последовательность,
последовательность ψ-петли.
То есть именно РНК, считанная с этой конструкции, будет упаковываться в вирион,
и она содержит самое сердце нашего эксперимента — собственно трансген.
Трансген в данном случае будет у нас кодировать зеленый флуоресцентный белок и
вирусы, которые будут содержать РНК, считанную с данной конструкции, также
будут содержать, получается, кодирующую часть зеленого флуоресцентного белка.
И при заражении клеток эти вирусы будут встраивать свою ДНК,
полученную с их РНК, в геном.
Соответственно, в геноме клеток, зараженных вирусом, будет ген зеленого
флуоресцентного белка и который при работе будет делать эти клетки зелеными.
То есть такой будет итог нашего эксперимента — мы получим вирусы,
которые при заражении клеток делают их зелеными.
Ну, давайте в первую очередь смешаем вот эти плазмидные конструкции,
кодирующие части вирусного генома.
[ЗВУК]
[ЗВУК]
[ЗВУК] И добавляем
к этой смеси определенное количество коммерческого реактива липофектамин,
который позволит образовать липосомы.
Именно в этих липосомах, внутри них и будут
находиться индивидуальные плазмиды.
Перемешиваем и оставляем на пять минут при комнатной температуре,
для того чтобы сформировались липосомы.
[ЗВУК] Теперь полученный
комплекс из липосом мы добавляем к клеткам.
[ЗВУК] Аккуратно
помешиваем, и за счет диффузии,
липосомы, которые мы добавили сейчас в среду,
достигнут клеток, сольются с ними, и плазмиды окажутся внутри клеток,
где начнутся процессы транскрипции и трансляции, что приведет к тому,
что внутри клеток будут все компоненты вирусного генома.
Это и нужно, единственное что нужно, для того чтобы собрался вирус.
Давайте оставим клетки на сутки в CO₂-инкубаторе,
и когда мы придем к ним завтра, наш вирус уже будет в культуральной среде.
[БЕЗ_ЗВУКА] Итак,
прошли сутки, и что же произошло с нашими клетками?
В первую очередь, обратите внимание на то, что цвет среды,
в которой они находятся, изменился, и он стал более желтым.
Это потому произошло, что клетки интенсивно делились, они потребляли
питательные вещества из среды и выделяли метаболиты, продукты распада,
которые являются кислыми, и из-за этого среда стала более кислой.
А поскольку в нее добавлен индикатор ph, который меняет цвет в зависимости от
кислотности среды, мы видим и изменения окраски на более желтую.
Давайте посмотрим на клетки под микроскопом.
Посмотрите, теперь клеток стало гораздо больше,
и они занимают практически всю поверхность культуральной чашки.
Это, собственно, говорит о том тоже, что клетки интенсивно делятся,
и у них всё в порядке.
Ну и теперь, помимо клеток, которые мы видим,
в культуральной среде содержится еще и невидимый в данный микроскоп вирус,
который, собственно, мы хотели приготовить.
Ну и поскольку работать теперь с такими клетками стало гораздо более опасно,
чем раньше, то мы для работы будем использовать
специально предназначенный для этого ламинар.
Пойдемте, начнем работу.
С вирусными частицами мы работаем,
используя специальный ламинар.
Особенности этого ламинара заключаются в том,
что его мотор направляет поток воздуха внутрь ламинара.
Сейчас вы это увидите.
Обратите внимание на пламя,
его как бы засасывает внутрь из наружной части ламинара.
Для чего это нужно?
Обычно, ламинары на самом деле работают с точностью до наоборот.
Они воздух выбрасывают изнутри ламинара наружу.
Такой поток воздуха изнутри наружу предотвращает попадание из
окружающей среды каких-то микрочастиц или микроорганизмов вовнутрь,
где у нас находятся наши клетки, которые мы боимся заразить микроорганизмами,
или в которые мы боимся занести микрочастицы.
Это называется «защита образца».
Но в данном случае мы отдаем приоритет не защите образца,
а защите исследователя от того, что находится внутри ламинара.
То есть такое направление воздуха,
когда он потоком проходит из окружающей среды, заходит внутрь ламинара,
предотвращает проникновение каких-то частиц изнутри ламинара наружу.
Воздух, который попадает внутрь, затем проходит через специальные фильтры,
которые расположены в верхней части ламинара,
и только после этого выбрасывается наружу.
Наличие фильтров тоже помогает предотвратить попадание каких-либо частиц
изнутри ламинара в окружающий воздух.
Ну и таким образом работать за таким ламинаром с вирусами гораздо безопаснее,
чем за обычным ламинаром.
Значит, как я уже сказал, на самом деле наши вирусы готовы и уже находятся в
среде, в культуральной среде клеток.
При формировании вирусы разрушают клетки,
внутри которых они собираются, и просто попадают в окружающую клетки среду.
Нам нужно просто механически их собрать пипеткой вместе со средой, но,
прежде чем использовать, нам необходимо эту среду с вирусами профильтровать.
Для чего мы ее фильтруем?
Мы фильтруем ее, поскольку в среде могут находиться какие-то единичные клетки,
которые отстали от поверхности чашки, могут,
если мы неаккуратно культивировали клетки, находиться какие-то микроорганизмы,
которые попали в культуральную среду (такое случается крайне редко,
но тем не менее, может случиться).
И для того, чтобы избавиться от клеток-упаковщиков,
которые могут быть в среде, или от каких-то микроорганизмов,
которые тоже в крайне редких случаях, но могут оказаться в среде,
мы профильтруем ее через фильтр с очень маленькими порами.
Размер пор составит всего лишь 0,45 микрометра.
Это очень-очень маленькая пора, через которую на самом деле может пройти
только вирус и некоторые, очень редкие, представители бактерий.
Эукариотические клетки, то есть клетки-упаковщики пройти через такую пору
не могут, то есть мы от них гарантированно избавимся.
Мы используем шприц, надеваем его на фильтр,
[БЕЗ_ЗВУКА] собираем
среду с клеток, содержащую вирус,
и аккуратно наносим ее на поверхность фильтра.
После чего используем поршень для того, чтобы продавить
среду через фильтр, и она попадает внутрь пробирки.
Обратите внимание на то, что все отходы, которые образовались у
нас и которые контактировали с вирусом, мы утилизируем специальным образом.
Мы собираем их сначала в определенную тару,
и затем все эти отходы будут автоклавированы.
Автоклавирование уничтожает вирусные частицы,
которые были в контакте с нашими инструментами.
И только после автоклавирования мы выбрасываем инструменты и пластик,
которым мы пользовались, в мусор.
Итак, мы получили вирус, профильтровав среду, снятую с клеток.
И теперь остается только заразить уже наши целевые клетки, которые мы хотим,
чтобы в них экспрессировался зеленый белок, остается заразить их вирусом.
Огромное преимущество трансгенеза при помощи вирусов состоит в том,
что заражение или инфекция проходит очень просто.
На самом деле нам всего лишь нужно добавить среду,
которая содержит вирусы,
к клеткам.
Слегка перемешиваем и оставляем на 48 часов.
Через двое суток вирусы заразят клетки, и мы сможем посмотреть,
все ли у нас прошло успешно, функциональный ли у нас вирус, оценить,
экспрессирует ли зеленый белок, производят ли зеленый белок зараженные клетки.
А сейчас оставим их на время заражения в CO2 инкубаторе.
Итак, сейчас мы надеемся, вирусы уже заразили клетки,
и в клетках был наработан зеленый флюоресцентный белок.
Давайте посмотрим, действительно ли это так,
при помощи флюоресцентного микроскопа.
Флюоресцентный микроскоп при помощи галогеновой лампы позволяет облучать
образец в широком диапазоне длин волн.
В частности, этот диапазон длин волн, который генерирует галогеновая лампа,
активирует флюоресценцию GFP.
И GFP, то есть зеленый белок,
активированный светом галогеновой лампы, испускает свет в зеленом спектре.
Это то, что мы ожидаем увидеть — что клетки будут зелеными.
Давайте посмотрим.
Мы видим зеленое свечение.
Это означает, что наши клетки имеют зеленый флюоресцентный белок.
Таким образом наш эксперимент удался.
Давайте еще раз обсудим то, что же мы сделали.
Мы сначала успешно доставили плазмидные конструкции, которые
кодировали части генома лентивируса, в вспомогательные клетки-упаковщики.
Сделали это мы при помощи трансфекции липофектамином.
После того,
как в клетках-упаковщиках оказались все необходимые компоненты генома вирусов,
были синтезированы РНК, которая, собственно, представляет собой геном,
и вспомогательные белки, которые входят в состав вирионов — вирусных частиц.
Вспомогательные белки упаковали РНК и сформировали вирион,
и сформированные вирионы разрушили клетки и оказались в окружающей клетки среде.
Мы эту среду собрали, профильтровали для того, чтобы избавиться
от клеток-упаковщиков, и вот таким фильтратом заразили наши целевые клетки,
которые мы, собственно, хотели сделать трансгенными.
И поскольку мы видим, что клетки синтезировали зеленый
флюоресцентный белок, это означает, что наше заражение произошло успешно.
За счет чего?
За счет того, что вирусы имели на поверхности рецепторы, не характерные
для лентивирусов, а рецепторы вируса везикулярного стоматита лошадей.
В противном случае у нас бы заражение не прошло, потому что нормальные лентивирусы
вообще вот этот тип клеток, который мы заражали, заражать не должны.
Затем, после того, как вирусы проникли внутрь клеток за счет рецепторов вируса
везикулярного стоматита лошадей, произошла обратная транскрипция,
то есть из РНК вируса образовалась ДНК, и тут важно помнить,
что мы в качестве именно вирусной РНК использовали конструкцию,
несущую трансген, то есть ген зеленого флюоресцентного белка.
Именно этот фрагмент ДНК был фланкирован, то есть окружен
вирусными концевыми повторами и содержал последовательность ψ-петли,
поэтому именно такая молекула РНК, считанная с этой ДНК, была упакована
в вирусы, и именно она теперь оказалась внутри наших целевых клеток.
И именно этот фрагмент ДНК был встроен в геном зараженных клеток,
и получается, в их геноме оказался ген зеленого флюоресцентного белка.
Ну, этот ген работал, то есть транскрибировался, образовывался белок,
и это привело к тому, что мы видим флюоресценцию в зеленом канале.
Таким образом, как я уже сказал, наш эксперимент оказался успешным,
и мы получили настоящую трансгенную линию клеток, с чем вас могу поздравить.
